Влияние низкой концентрации мелатонина на качество хранимых эритроцитов in vitro

Введение

Трансфузии эритроцитов являются важной составной частью интенсивной терапии и часто используются у больных с острой массивной кровопотерей, ожогами, анемией, хирургическим вмешательством, злокачественными новообразованиями и тяжелыми травмами. Они незаменимы для улучшения снабжения кислородом, содействуют коагуляции, спасают жизнь больных. Однако концентраты эритроцитов при хранении in vitro претерпевают ряд биохимических и морфологических изменений [1],[2], которые приводят к повреждению мембран эритроцитов, уменьшают их функциональные свойства. Поэтому в последние годы проблемы улучшения качества хранения и продления времени хранения эритроцитов стали темами многих исследований. Истощение энергии и окислительное повреждение являются ключевыми факторами разрушения эритроцитов в процессе хранения [3],[4]. Для уменьшения окислительного повреждения в раствор добавляют антиоксиданты. В настоящее время имеются сообщения об использовании эндогенных антиоксидантов, таких как витамин Е [5], витамин С [6],[7], глутатион [8],[9] и N-ацетилцистеин [10], и некоторых экзогенных фенольных соединений, таких как пропофол [11]. Добавление большинства из этих антиоксидантов улучшает в определенной степени качество хранения эритроцитов, но не может полностью противодействовать сильному окислительному повреждению. Это происходит потому, что существует много разных видов свободных радикалов, и единственный поглотитель свободных радикалов не может эффективно блокировать полиморфную цепную реакцию. Для решения этой проблемы были изучены защитные эффекты витамина С [10],[12], витамина Е [5],[12], цистеина [13] и их комбинаций [10]. При использовании всех их были достигнуты некоторые антиоксидантные эффекты за счет поглощения гидроксильных радикалов, стабилизации клеточной мембраны и поглощения H₂O₂ . Однако витамин С может быть легко окислен сам по себе, и эритроциты будут дополнительно повреждены образованием свободных радикалов. Кроме того, аддитивные растворы витамина С, цистеина и глутатиона водорастворимы, и поэтому их можно легко растворить, но трудно ввести в эритроциты. В противоположность этому, используемый в качестве липофильного антиоксиданта витамин Е может поступать в клетку, но его трудно растворить в растворе. Изучение аддитивных растворов проводится уже много лет, но, несмотря на это, ситуация с повреждением эритроцитов при хранении существенно не улучшилась.

Мелатонин (МТ), также известный как N-ацетил5-метокситриптамин, представляет собой гормон, синтезируемый и секретируемый шишковидной железой [14]. Он обладает широким спектром физиологических функций и влияет на биологические часы, регулирует иммунную систему и оказывает антиоксидантное действие, действуя как прямой поглотитель свободных радикалов, а также путем повышения экспрессии и активности эндогенных антиоксидантных ферментов [15],[16]. Кроме того, МТ может оказывать антиоксидантное действие на мембрану и на цитозол из-за его липофильных и гидрофильных свойств. Ввиду этого предполагается, что МТ может явиться полезным аддитивным раствором для хранения концентратов эритроцитов.

Некоторые исследования показали, что про- и антиоксидантные свойства МТ зависели от типа клеток, окислительно-восстановительного состояния, а также условий эксперимента [17]. Концентрация МТ в сыворотке человека днем ниже (10–20 пг/мл), а ночью выше (30–120 пг/мл), достигая пика примерно в 3 часа утра [18]. Общая пероральная доза МТ, используемого в качестве снотворного препарата, составляет от 1 до 3 мг, концентрация лекарственного средства в крови достигает более 1,9 нг/мл через 1 час. М.R. Şekeroğlu и соавт. [11] показали, что МТ в концентрации 500 пг/мл может предотвращать накопление малонового диальдегида (МДА) и сохранять концентрации глутатиона, глутатион пероксидазы и супероксид дисмутазы, но не влияет на каталазу эритроцитов. М. Allegra и соавт. [19] показали, что МТ не только предотвращает выработку МДА, но и предотвращает повреждение эритроцитов, вызываемое МДА. В некоторых исследованиях сообщалось об ограниченной антиоксидантной активности МТ [20] или даже приводились доказательства его проокислительных свойств [21],[22],[23],[24].

Цель настоящей работы — изучить влияние низкой концентрации МТ на морфологию, агрегацию, окислительный стресс и метаболизм глюкозы эритроцитов при их долговременном хранении.

Материалы и методы

Сбор и подготовка проб

Исследование было одобрено комитетом по этике Медицинского колледжа Баотоу. Были рекрутированы 6 здоровых добровольцев в возрасте 18–23 лет. Все добровольцы перед сдачей крови подписали информированное согласие, у каждого из них было взято по 200 мл цельной крови. После лейкодеплеции эритроциты ресуспендировали с помощью 50 мл раствора MAP (лимонная кислота 0,20 г, дигидрат цитрата натрия 1,50 г, глюкоза 7,93 г, дигидрофосфат натрия 0,94 г, хлорид натрия 4,97 г, аденин 0,14 г, маннит 14,57 г в каждых 1000 мл раствора). Эритроциты осторожно перемешивали, а затем равномерно распределяли по двум пакетам. Основным компонентом пакета крови являлся пластифицированный поливинилхлорид (ПВХ) с двухэтилгексиловым эфиром (DEHP) (медицинские полимерные продукты группы Shandong Weigao Co., Ltd, Шаньдун, Китай). МТ добавляли в один мешок (группа МТ) для достижения конечной концентрации 150 пг/мл, в другой мешок добавляли равный объем растворителя без МТ (контрольная группа). Эритроциты затем хранили при 4 ± 2 °С. При сроке хранения 0, 7, 14, 21, 28, 35 и 42 дня из каждого пакета после осторожного смешивания суспензии отбирали по 5 мл образца крови и направляли для исследования.

Определение морфологии эритроцитов

Суспензию эритроцитов объемом 50 мкл использовали для изготовления мазка крови, который окрашивали по Гимзе. Морфологию эритроцитов исследовали под микроскопом (увеличение ×100), количество деформированных эритроцитов подсчитывали на 1000 эритроцитов.

Определение индекса агрегации эритроцитов

Для определения агрегации эритроцитов использовали автоматический реометр крови LBY-N6C.

Определение относительной скорости гемолиза

Суспензию эритроцитов объемом 1 мл центрифугировали при 3000 об./мин в течение 5 мин. Затем отбирали 200 мкл супернатанта и разбавляли деионизированной водой. С помощью многофункционального считывателя микропланшетов (Thermo 3001) определяли поглощение в супернатанте при 540 нм. Поглощение 50 раз разбавленного гемолизата использовали в качестве эталона, относительную скорость гемолиза каждого образца рассчитывали, используя приведенную ниже формулу:

Относительная скорость гемолиза = поглощение образца/поглощение эталона.

Определение метгемоглобина (MetHb), глюкозы и молочной кислоты

Концентрацию MetHb, глюкозы и молочной кислоты определяли с помощью газоанализатора крови ABL 90.

Определение рН, МДА и АТФ

pH образца крови определяли с использованием измерителя Mettler Toledo. Концентрацию МДА определяли в соответствии с инструкциями набора (S0131, Институт биотехнологии Бейотима). Содержание АТФ в эритроцитах определяли в соответствии с набором для обнаружения АТФ (S0027, Институт биотехнологии Бейотима).

Статистический анализ. Для статистики и анализа данных использовали статистическое программное обеспечение GraphPad Prism 5.02. Результаты измерений выражали в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Для статистического анализа использовали двусторонний анализ дисперсии (ANOVA). В качестве статистически значимой разницы принимали p < 0,05.

Результаты

МТ уменьшил количество деформированных эритроцитов на конечной стадии хранения

Мазок крови использовали для наблюдения морфологии эритроцитов. Как показано на рисунке 1А, при длительном времени хранения морфология эритроцитов изменялась от гладкого двойного вогнутого диска к акантоцитам, гладким сферическим и акантусным эритроцитам как в контрольной группе, так и в группе МТ. Статистический анализ (рис. 1В) показал, что на количество деформированных эритроцитов влияло как время хранения (p < 0,0001), так и концентрация МТ (p < 0,0001), между ними была взаимосвязь (p < 0,0001). Количество деформированных эритроцитов в группе МТ было значительно меньше, чем в контрольной группе на 21-й, 28-й, 35-й и 42-й дни (p < 0,0001).

МТ снижает относительную скорость гемолиза на конечной стадии хранения

Относительная скорость гемолиза отражает разрушение эритроцитов. На относительную скорость гемолиза влияли как время хранения (p < 0,0001), так и концентрация мелатонина (p < 0,01), между ними была выявлена значимая связь (p < 0,01) (рис. 3). По сравнению с контрольной группой относительная скорость гемолиза группы МТ была значительно ниже на 42-й день (p < 0,0001).

Влияние МТ на индекс агрегации эритроцитов на этапе конечного хранения

Индекс агрегации эритроцитов был изучен на автоматическом реометре крови LBY-N6C. Как показано на рисунке 2, индекс агрегации эритроцитов постепенно повышался как в контрольной, так и в МТ группах во время хранения эритроцитов. Статистический анализ (рис. 2) показал, что как время хранения (p < 0,0001), так и концентрация МТ (p < 0,01) влияли на индекс агрегации, но между ними отсутствовала значимая связь (p > 0,05). Индекс агрегации в группе МТ был ниже, чем в контрольной группе, на 35-й день (p = 0,0602) и 42-й день (p = 0,0542), но не было существенной разницы в эти дни в группе МТ.

MT уменьшал концентрацию МДА на конечной стадии хранения

MДА является одним из конечных продуктов перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот в клетках, и содержание MДА обычно используется в качестве маркера для отражения окислительного стресса и антиоксидантного статуса. Исследование показало (рис. 3А), что как время хранения (p < 0,0001), так и концентрация МТ (p < 0,0001) влияли на МДА и между ними существовала связь (p < 0,01). По сравнению с контрольной группой относительная скорость гемолиза в группе МТ была значительно ниже на 35-й день (p < 0,05) и 42-й день (p < 0,0001).

MT уменьшал MetHb на конечной стадии хранения

MetHb образуется в результате обратимого окисления гемового железа (Fe2⁺) до трехвалентного состояния (Fe3⁺). Это реактивная молекула, которая может дополнительно усиливать окислительный стресс и вызывать осмотическую хрупкость и внутрисосудистый гемолиз. Как показано на рисунке 3В, время хранения (p < 0,0001) и концентрация МТ (p = 0,0002) влияли на MetHb, но между ними отсутствовала связь (p > 0,05). Концентрация MetHb в группе МТ была значительно меньше, чем в контрольной группе на 42-й день (p < 0,0001).

Влияние МТ на концентрацию глюкозы

Глюкозу в добавочном растворе рассматривали как основной источник энергии эритроцитов. Концентрация глюкозы снижалась со временем хранения (p < 0,0001) (рис. 4А), на нее не влияла концентрация МТ (p > 0,05), и между ними не было никакой связи (p > 0,05).

Влияние МТ на концентрацию молочной кислоты

Молочная кислота является конечным продуктом анаэробного окисления глюкозы. При хранении молочная кислота накапливалась, и ее концентрация увеличивалась со временем хранения (p < 0,0001), но на нее на влияла концентрация МТ (p > 0,05), и между ними не было значимой связи (p > 0,05) (рис. 4В).

Влияние МТ на концентрацию АТФ эритроцитов

АТФ является прямым источником энергии для жизнедеятельностиэритроцитов. КонцентрацияАТФпостепенно уменьшалась со временем хранения (p < 0,0001), но на нее на влияла концентрация МТ (p > 0,05), и между ними не было связи (p > 0,05) (рис. 4С).

Обсуждение

Хранящиеся концентраты эритроцитов рассматриваются как основной источник для проведения трансфузионной терапии. Качество хранящихся эритроцитов зависит от состава аддитивного раствора и условий их хранения. Однако аддитивный раствор может задерживать старение эритроцитов, но не предотвращает их старение. Другими словами, эритроциты претерпевают ряд морфологических, функциональных и биохимических изменений, которые становятся все более очевидными с увеличением длительности хранения. Чтобы уменьшить или отсрочить повреждение эритроцитов во время хранения, необходимо найти эффективные добавки или составы для их сохранения. Это проблема исследуется во многих работах, посвященных хранению компонентов крови. У млекопитающих МТ не только регулирует циркадный и сезонный ритмы, тонус сосудов и подавляет развитие рака, но и является эффективным антиоксидантом как in vivo, так и in vitro [25],[26]. В качестве поглотителя гидроксильных радикалов его поглощающая способность в 4 раза превышает глутатион и в 14 раз — маннит [27],[28]. В качестве эффективного липофильного антиоксиданта поглощающая активность алкил-пероксид радикала в 2 раза превышает активность витамина Е [28]. Более того, М. Allegra и соавт. показали, что МТ может непосредственно удалять свободные радикалы, продуцируемые в эритроцитах [19]. Концентрация МТ в сыворотке обычно составляет менее 120 пг/мл (примерно 66 пг/мл концентрации цельной крови), а концентрация снотворного лекарственного средства в крови составляет более 1900 пг/мл (примерно 1045 пг/мл концентрации цельной крови). В этом исследовании защитные эффекты 150 пг/мл (концентрация цельной крови) МТ на эритроциты наблюдались во время длительного хранения эритроцитов.

Во-первых, морфология эритроцитов наблюдалась в различные моменты времени хранения. Как показано на рисунке 1А, имели место регулярные дегенеративные изменения морфологии эритроцитов (от гладкого двойного вогнутого диска до покрытых шипами или гладких шаровидных в обеих группах), ивсе большеибольше эритроцитов агрегироваливмазкекрови, постепенноувеличиваясьвместесиндексом агрегации эритроцитов. Кроме того, при непрерывном разрушении эритроцитов относительная скорость гемолиза эритроцитов также увеличивалась. По сравнению с контрольной группой количество деформированных эритроцитов и относительная скорость гемолиза группы МТ значительно уменьшились на конечной стадии хранения. Индекс агрегации в группе МТ был ниже, чем в контрольной группе в дни 35 (p = 0,0602) и 42 (p = 0,0542), но разница не является статистически значимой, что может быть обусловлено небольшим количеством образцов. Из вышеприведенных результатов можно предварительно сделать вывод, что низкая концентрация МТ оказывает защитное влияние на долговременно хранящиеся эритроциты. Далее влияние МТ на окислительный стресс и метаболиты глюкозы хранимых эритроцитов измеряли в разное время хранения.

Окислительный стресс является одним из важных факторов повреждения эритроцитов при хранении. Для дальнейшего раскрытия защитного механизма MT были изучены такие индикаторы окислительного стресса, как MДA и MetHb. МДА рассматривается как один из важнейших продуктов перекисного окисления липидов мембран и косвенно отражает степень окислительного повреждения [23]. MetHb является гемоглобином, но не может транспортировать O₂ . MetHb возникает, когда оксигемоглобин в состоянии железа Fe2⁺ преобразуется в состояние железа Fe3⁺ . Низкие концентрации MetHb (< 3 %) всегда присутствуют в кровотоке, но они заметно увеличиваются после воздействия определенных патологических состояний. MetHb также действует как важный окислительныймаркер эритроцитов. Содержание MДA и MetHb постепенно увеличивалось со временем хранения в обеих группах, и это может быть связано с уменьшением восстановительных веществ, таких как никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ) в эритроцитах. НАДФ продуцируется пентозофосфатным путем и является коферментом глутатионредуктазы, которая отвечает за восстановление окисленного глутатиона до восстановленного глутатиона. При низкой температуре хранения эритроцитов пентозофосфатный путь замедляется, что приводит к уменьшению содержания НАДФ и глутатиона. Глутатион является существенным компонентом антиоксидантного стресса. В этом исследовании предполагалось, что уменьшение концентрации глутатиона коррелирует с увеличением концентрации MДA и MetHb. Однако концентрация MДA и MetHb в группе MT была ниже, чем в контрольной группе, что указывает на то, что низкая концентрация MT может уменьшить окислительный стресс и защитить хранящиеся эритроциты.

Гликолиз рассматривается как основной источник энергии эритроцитов. Этот путь расщепляет глюкозу с образованием АТФ и молочной кислоты. Накопление молочной кислоты снижает рН раствора для хранения. В нашем исследовании концентрация глюкозы и АТФ постепенно уменьшалась, и молочная кислота постепенно накапливалась с увеличением времени хранения в обеих группах, однако статистически значимых различий между контрольной группой и группой МТ не наблюдалось. Поэтому мы предположили, что защитный эффект низкой концентрации МТ реализуется в основном через антиоксидантную функцию МТ, но также может влиять метаболизм глюкозы хранящихся эритроцитов, что усиливает пентозофосфатный путь, уменьшая при этом гликолиз и потребление энергии по какому-то неизвестному механизму, улучшая условия среды и способствуя «выживанию» хранящихся эритроцитов.

А. Krokosz и соавт. [17] показали, что длительная инкубация эритроцитов в присутствии МТ в количестве от 0,02 до 3 мМ в течение до 96 ч при 37 °C индуцировала прогрессирующее деструкцию эритроцитов. Чтобы избежать возможного повреждающего действия высоких концентраций МТ на эритроциты, в нашем эксперименте первоначально исследовали влияние низких концентраций (150 пг/мл) МТ на хранение эритроцитов. Результаты показали, что МТ не только защищает морфологию эритроцитов, улучшает индекс гемолиза и агрегации, но и уменьшает окислительный стресс. Стоит отметить, что в середине и конце сроков хранения потребление глюкозы и АТФ и накопление лактозы в группе МТ были ниже, чем в контрольной группе, хотя статистически значимых различий не наблюдалось. Тенденции этих трех связанных показателей оставались неизменными. В последние годы некоторые исследования показали, что повышенная регуляторная роль МТ связана с метаболизмом глюкозы в некоторых типах клеток [29],[30]. Поэтому предполагалось, что МТ усиливает пентозофосфатный путь, уменьшая при этом гликолиз и потребление энергии с помощью какого-то неизвестного механизма, улучшая условия хранения эритроцитов. В дальнейших исследованиях диапазон концентраций МТ должен быть расширен, чтобы наблюдать влияние на метаболизм глюкозы хранимых эритроцитов. Эти исследования обеспечат теоретическую основу для разработки более эффективного решения для хранения эритроцитов.