Молекулярно-генетическая верификация болезни Виллебранда тип 2N

Введение

Болезнь Виллебранда (БВ) названа именем финского врача Эрика Адольфа фон Виллебранда, который впервые описал ее в 1926 г., выделив среди других случаев врожденных геморрагических диатезов и гемофилии [1]. От гемофилии, по его описанию, это наследственное заболевание отличалось тем, что подвержены ему были и женщины, и мужчины, а также тем, что оно не было ассоциировано с кровоизлияниями в мышцы и суставы, а проявлялось носовыми кровотечениями, а также спонтанными желудочно-кишечными кровотечениями, меноррагиями, а также неконтролируемыми кровотечениями при травмах [1]. Заболевание наследуется аутосомно (есть доминантные и рецессивные формы) и обусловлено изменениями в гене vWF [2], кодирующем фактор фон Виллебранда (von Willebrand Factor, vWF) — мультимерный гликопротеин, имеющий две основные функции: связывание с поверхностью тромбоцитов и с субэндотелиальной соединительной тканью с образованием мостиков между тромбоцитами и поврежденными участками сосудов; и связывание с фактором свертывания VIII (FVIII), препятствуя деградации последнего [3]. БВ делится на типы: 1-й тип, обусловленный уменьшением количества vWF, 3-й тип, обусловленный отсутствием vWF, и 2-й тип, обусловленный изменением структуры vWF. В свою очередь, 2-й тип делится на подтипы A, B, M и N [4]. Тип 2N называют «нормандским» в честь региона Франции, где был выявлен первый больной с этим диагнозом. Он характеризуется нарушением связи vWF c FVIII [4] и дифференцируется от других типов БВ на основании соотношения FVIII:C/vWF:Ag меньше 0,7 [5]. В то же время отличие типа 2N БВ от гемофилии A не всегда бывает очевидным [2]. Однозначный ответ на вопрос, есть ли у больного 2N тип БВ, дает прямой анализ на способность vWF связываться с FVIII [5]. Для этого анализа производятся коммерческие наборы [6], однако они применяются редко [5]. Необходимость различать 2N тип БВ, БВ других типов и гемофилию А продиктована различными подходами к их лечению.

Первая линия лечения БВ — это терапия десмопрессином (DDAVP, аналог вазопрессина), он используется как при легкой форме гемофилии А, так и при легком течении БВ [5]. Такое лечение может быть как эффективным, так и неэффективным. Эффективность при типе 2N зависит от генных изменений, вызвавших болезнь [7][8]. В России десмопрессин не используется, а основным методом лечения БВ является заместительная терапия [9]. Ее же используют и за рубежом при неэффективности лечения десмопрессином [5]. В случае БВ, включая тип 2N, важно, чтобы используемый препарат содержал одновременно vWF и FVIII, причем концентрация FVIII не должна превышать концентрацию vWF, т. к. создание избыточной активности FVIII в крови больных БВ в сравнении с активностью vWF может привести к развитию тромбозов [10].

БВ вызывается патологическими изменениями в гене vWF, а гемофилия А — изменениями в гене F8. Однако имеются больные, у которых присутствуют изменения в обоих генах [5]. Ген vWF находится в области короткого плеча 12-й хромосомы (12p13.31), его длина около 178 тпн, и он состоит из 52 экзонов [11]. Существует частичная копия этого гена — непроцессированный псевдоген на длинном плече 22-й хромосомы (22q11–13), включающий экзоны 23–34 и имеющий гомологию с геном 97 % [12]. Тип 2N наследуется рецессивно, т. е. вызывается либо патогенными вариантами в гомозиготном состоянии, либо двумя гетерозиготными вариантами, расположенными на разных аллелях (компаунд). В случае компаундного генотипа оба патогенных варианта могут быть ассоциированы с типом 2N, т. е. нарушать структуру сайта связывания с FVIII, либо один из вариантов может быть ассоциирован с 2N типом, а второй (на другом аллеле) — выводить из строя аллель целиком (нонсенс-мутация, делеция, инсерция, мутации зоны сплайсинга) — «нулевая мутация» [13]. vWF имеет доменную структуру. За связь с FVIII отвечают домены D`и D3, которые, в свою очередь, делятся на субдомены TIL`-E`-VWD3-C8_3-TIL3-E3 и кодируются экзонами 18–28 [14][15] (рис. 1). D` домен непосредственно контактирует с FVIII, но домен D3 тоже играет в этой связи определенную роль [5]. Теоретически можно предположить, что патогенные варианты, вызывающие БВ типа 2N, должны располагаться в экзонах 18–28. Патогенные варианты у больных, у которых диагностирован 2N тип, локализованы в экзонах 17–21, 24, 25, 27 [3]. Если соотнести экзоны с доменами, то окажется, что экзон 17 находится за пределами доменов D`D3, но патогенные варианты в нем все равно могут вызывать тип 2N [3]. Экзоны же 22, 23, 26 и начало 28-го попадают в домен D3, но в них неизвестны варианты, ассоциированные с 2N.

Целью настоящей работы было выявление больных с типом 2N БВ на основании молекулярно-генетических методов.

Материалы и методы

В работу включены 4 больных, для каждого из которых были получены образцы крови и анамнестические данные: двое больных из ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России (Москва) и по одному больному — из ГАУЗ СО Центр детской онкологии и гематологии (Екатеринбург) и ФГБОУ ВО «СЗГМУ им И.И. Мечникова» Минздрава России (Санкт-Петербург).

Кровь больных была направлена в лабораторию генной инженерии для проведения генетического исследования после того, как лечащим врачом на основании наличия в анамнезе кровотечений, характерных для БВ, и данных коагулогических тестов был установлен диагноз БВ. Для больных, у которых были определены vWF:Ag и FVIII:C, рассчитывали соотношение FVIII:C/vWF:Ag. В исследование включали только больных с соотношением FVIII:C/vWF:Ag менее 0,7. Было выявлено двое таких больных (№ 1, № 3).

Кровь больного № 2 была направлена в лабораторию для подтверждения диагноза «гемофилия А», который был установлен на основании анамнестических данных о тяжелых кровотечениях в сочетании со сниженной плазменной активностью FVIII:C, однако по результатам исследования гена F8 у него не было выявлено патогенных вариантов. Результаты исследования соотношения FVIII:C/vWF:Ag у этого больного были получены уже после получения данных молекулярно-генетического анализа гена vWF и оказались меньше 0,7.

У больной № 4 проводили дифференциальный диагноз между типом 2N БВ и носительством гемофилии А. У этой больной были исследованы FVIII:C и vWF:Ag, соотношение FVIII:C/vWF:Ag составило < 0,7, поэтому образцы ее крови были направлены на исследование.

Концентрация в плазме vWF:Ag была измерена иммунотурбидиметрическим методом. Активность в плазме фактора VIII (FVIII:C) была измерена клоттинговым методом, ристоцетин кофакторную активность (vWF:RCo) измеряли агрегационным методом, активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) — клоттинговым методом (табл. 2).

Методы экстракции ДНК, полимеразной цепной реакции (ПЦР), очистки продуктов ПЦР, секвенирования и анализа полученных нуклеотидных последовательностей описаны ранее [16].

Для постановки молекулярно-генетического диагноза были проанализированы следующие экзоны гена vWF: 17–21, 24, 25, 27, 28. Праймерные системы для амплификации вышеперечисленных экзонов представлены в таблице 1. Позиции праймеров и номенклатура патогенных вариантов указаны согласно референсной последовательности NCBI NG_009072. Температура отжига для всех пар праймеров была 62 °С.

Поскольку наследование типа 2N рецессивное, то диагноз считали подтвержденным при наличии двух патогенных вариантов. В случае, если в указанных экзонах обнаруживали два патогенных варианта, соответствующих типу 2N, поиск завершали. Если в указанных экзонах находили только один вариант, соответствующий типу 2N, то проводили поиск по остальным экзонам гена vWF, чтобы найти нарушение, целиком прекращающее работу второго аллеля. Пары праймеров для экзонов, где были обнаружены изменения, приведены в таблице 1. Праймерные системы, разработанные в лаборатории генной инженерии, позволяют исключить параллельную амплификацию соответствующих фрагментов псевдогена. Патогенность новой мутации была определена согласно классификатору American College of Medical Genetics (ACMG) [17].

Результаты

У всех включенных в исследование больных диагноз тип «2N БВ» был подтвержден молекулярно-генетическими методами. У каждого больного найдено два патогенных варианта гена vWF, и хотя бы один из них локализован в области, отвечающей за связь с FVIII (табл. 3).

У двух больных (№ 1 и № 2) найден один и тот же набор патогенных вариантов в гетерозиготном состоянии в субдомене TIL домена D`: c.2435delC и c.2372 C>T Thr791Met. Это компаундное сочетание замены Thr791Met, ассоциированной с БВ типа 2N, и делеции c.2435delC, приводящей к отсутствию функционального фактора [18]. Исходно в одном случае была диагностирована БВ, в другом — гемофилия А.

У больной № 3 выявлена замена p.Arg816Trp в сочетании с неописанной ранее инсерцией c.2098_2099insG. Обе вариации представлены в гетерозиготном состоянии и локализованы в субдомене TIL` домена D`. Новый вариант c.2098_2099insG соответствует критериям патогенного варианта ACMG (PVS:1, PS:1, PM:1).

У больной № 4 обнаружена замена p.Arg854Gln в гомозиготном состоянии в субдомене E` домена D`.

Обсуждение

Данные по двум (№ 1 и № 2) из 4 больных, включенных в исследование, были частично опубликованы ранее [16]. Изменения в гене, выявленные у этих больных, одинаковы, но тяжесть заболевания различна. Значение FVIII:C для больного № 2 составило 5,9 %, а наблюдаемая клиническая картина соответствовала течению гемофилии А. У больного были гемофилические артропатии всех крупных суставов в результате кровоизлияний, что характерно для тяжелого течения гемофилии А, но при этом в анамнезе были также десневые, носовые и желудочно-кишечные кровотечения, более характерные для БВ. Кровь больного была направлена в лабораторию для верификации диагноза «гемофилия А», но в гене F8 патогенных изменений найдено не было, поэтому был проанализирован ген vWF. Пример этого больного подтверждает важность использования молекулярных методов для дифференциального диагноза между 2N типа БВ и гемофилией А.

У больной № 1 была диагностирована БВ, но не уточнен тип заболевания. У нее наблюдались симптомы, типичные для БВ: меноррагии, десневые кровотечения, кровотечения из лунок после удаления зубов и гематома после аппендэктомии.

Генетический анализ больной № 4 был проведен для дифференциальной диагностики между 2N БВ и носительством гемофилии А с целью планирования семьи. Молекулярный анализ позволил определить выявленную у нее замену p.Arg854Gln в гомозиготном состоянии как патогенный вариант, обусловливающую развитие типа 2N БВ.

Кровь больной № 3 была направлена в лабораторию в связи с диагнозом БВ у больной, однако тип БВ не был установлен. Значение vWF:Ag, составившее 58,2 %, было в пределах нормы, при этом определялась низкая активность FVIII:C, оставлявшая 5,6 %, что было характерно для типа 2N БВ. Выявленная у нее замена p.Arg816Trp описана как вызывающая тип 2N, но в гетерозиготном состоянии ее недостаточно для появления симптомов. У этой больной найден второй патогенный вариант в гетерозиготном состоянии — c.2098_2099insG. Эта инсерция не описана ранее в литературе, однако ее патогенность очевидна (frameshift-мутация в середине гена — это «нулевая мутация»). Сочетание «нулевой мутации» с патогенным вариантом типа 2N, а также лабораторные данные позволяют заключить, что у больной именно 2N тип БВ.

Результаты коагулогического анализа (табл. 2) характерны для больных с типом 2N БВ [5], но для больных № 2, № 3, № 4 эти данные также можно было бы интерпретировать как гемофилию А или ее носительство: АЧТВ удлинено, vWF:Ag, vWF:Co в пределах нормы, активность FVIII:C снижена. Больные № 1, 3, 4 — женщины. Возможно, что представления о гемофилии А как болезни, свойственной только для мужчин, а БВ как болезни, не привязанной к полу, позволили в их случае верно определить диагноз как БВ, в то время как для больного № 2, учитывая мужской пол, по умолчанию предположили гемофилию А.

Выявленные замены p.Thr791Met, p.Arg816Trp и p.Arg854Gln являются наиболее частыми среди патогенных изменений, вызывающих тип 2N [13]. Для них известен механизм патогенного эффекта, обусловливающего развитие типа 2N [14]. Данные замены находятся в домене D`, ответственном за связь с FVIII (рис. 1). Замены p.Thr791Met и p.Arg816Trp расположены в субдомене TIL` в области, формирующей положительный заряд этого субдомена. Положительный заряд необходим для связи с а3 доменом FVIII, который является главным из двух сайтов, обеспечивающих связь между vWF и FVIII [14]. Моделирование показывает, что эти замены ведут к потере положительного заряда в предполагаемом регионе связывания домена а3 FVIII [14]. Замена p.Arg854Gln локализована в субдомене E` и тоже ведет к потере положительного заряда, однако точный механизм ее влияния остается неясным. Эта замена встречается очень часто среди европеоидов [3]. Известна реакция на лечение десмопрессином больных, имеющих найденные в настоящей работе варианты. Для больных с заменой p.Arg854Gln оно эффективно [7], это частый патогенный вариант, и нарушения, вызываемые им, сравнительно легкие. При заменах p.Arg816Trp, p.Thr791Met лечение десмопрессином неэффективно [7][8].

Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что молекулярно-генетический анализ, основанный на определении мутаций в гене vWF, дает возможность эффективно отличать БВ 2N типа не только от других типов этого заболевания, с чем вполне успешно справляются коагулогические тесты, но и от гемофилии А, что не всегда удается сделать с их помощью [5].