Исследование ассоциации гаплотипа 46/1 гена янус-киназы 2 (JAK2) и драйверных мутаций хронических Ph-негативных миелопролиферативных новообразований

Введение

Относительно устойчивая комбинация однонуклеотидных замен в гене JAK2 — «гаплотип 46/1» — ассоциирована с более частым развитием Ph-негативных миелопролиферативных новообразований (МПН) и с повышенной частотой выявления и величиной аллельной нагрузки мутации JAK2 V617F, характерной для данной группы онкогематологических заболеваний [1–5]. Молекулярные механизмы такой ассоциации неизвестны. Среди предлагаемых гипотез рассматриваются гипотеза «гипермутабельности» данного локуса за счет прямого взаимодействия с соседними последовательностями нуклеотидов, характерных для гаплотипа 46/1, и гипотеза «благоприятной почвы», обусловленной непрямыми влияниями других ассоциированных генов гаплотипа на склонность к провоспалительным реакциям. Ранее не проводили исследования частоты носительства гаплотипа 46/1 JAK2 в региональных, возрастных и гендерных выборках, что могло бы объяснить противоречивость оценки степени данной ассоциации в различных работах.

Оценка выраженности ассоциации между унаследованным вариантом гена JAK2 и соматической мутацией JAK2V617F различается в отдельных публикациях: отношение шансов риска развития V617F-позитивного МПН у обладателей гаплотипа 46/1 составляет от 1,5 [3] до 8,8 [4]. В отличие от общепризнанной связи гаплотипа 46/1 с JAK2V617F, его ассоциация с другими драйверными мутациями МПН в гене кальретикулина (CALR) отсутствовала [6][7], или была значимой, но слабой [8], а также была противоречивой в случае с мутациями гена рецептора тромбопоэтина (MPL) [9][10].

Ранее в предварительных исследованиях было показано, что степень ассоциации гаплотипа 46/1 с JAK2V617F отличалась в выборках проб, собранных у больных в разных регионах Сибири [11], а также зависела от пола и возраста включенных в исследование больных [12]. Кроме того, не выявлено влияние гаплотипа 46/1 у больных с низкой аллельной нагрузкой JAK2V617F (менее 2 %), характерной для клонального гемопоэза неопределенного пролиферативного потенциала [13]. Исследование региональных, возрастных и гендерных особенностей влияния носительства гаплотипа 46/1 в отношении развития драйверных мутаций МПН ранее целенаправленно не проводилось. Вместе с тем использование результатов определения гаплотипа 46/1 при его высокой корреляции с риском развития МПН могло бы стать дополнительным лабораторным маркером в дифференциальной диагностике злокачественных новообразований кроветворной системы. В настоящей работе представлены итоговые данные анализа результатов тестирования гаплотипа 46/1 и JAK2V617F на объединенной межрегиональной выборке больных с подозрением на МПН.

Цель — анализ ассоциации между гаплотипом 46/1 и мутацией V617F гена JAK2 с полом, возрастом и местом проживания больных, обследованных в связи с подозрением на хронические МПН.

Материалы и методы

В работе использованы 949 архивных образцов ДНК больных с подозрением на МПН, направленных гематологами для исследования мутационного статуса в лабораторию Красноярского филиала ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, в том числе образцы ДНК, выделенные из сухих пятен капиллярной крови 73 больных из Республики Саха (Якутия), 90 больных из Республики Хакасия, 39 больных из Республики Тыва, 174 больных из Иркутской области, 5 — из Республики Бурятия и суммарно 27 больных из Братска, Владивостока и Норильска.

Выделение ДНК из сухих пятен крови проводили в соответствии с методом, разработанным в ФИЦ КНЦ СО РАН. Соответствие результатов, получаемых при исследовании соматических мутаций МПН при тестировании проб цельной крови и их «сухих пятен крови», показано было ранее [14].

Определение гаплотипа 46/1 (rs10974944), мутации JAK2V617F, а также мутации в гене CALR (тип 1: c.1092_1143del; L367fs*46, COSV57116546; тип 2: c.1154_1155insTTGTC; K385fs*47, COSV57116551) и в гене MPL (W515K, W515L) проводили с использованием наборов ООО «Формула гена» методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Предел чувствительности теста определения мутации V617F составлял 0,03 % от ДНК клеток венозной крови. В исследование были также включены 139 образцов ДНК проб крови больных с подозрением на МПН из архива лабораторий Центра молекулярной диагностики г. Москвы (ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора), где определение гаплотипа 46/1 (rs3780367), а также мутаций в генах CALR, MPL и мутаций в 12-м экзоне JAK2 проводили методом пиросеквенирования c применением системы генетического анализа «PyroMark Q24» («Qiagen», Германия) [15]. Анализ носительства JAK2V617F выполняли с использованием методик согласно [16]. Результаты определения JAK2V617F в 87 пробах из настоящей выборки были исследованы параллельно в двух лабораториях и различий в получаемых результатах не наблюдалось. Также на выборке 96 проб наблюдалось полное совпадение результатов двух лабораторий по выявлению сцепленных аллелей rs10974944 и rs3780367, характерных для гаплотипа 46/1.

В контрольную группу для оценки распространенности гаплотипа 46/1 среди людей, не имевших симптомов МПН, были включены пробы 150 добровольцев и доноров крови. Половой и возрастной состав обследованных лиц в отдельных группах представлен в таблицах 1 и 2.

Статистический анализ. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica 10 (StatSoft Inc., США), используя критерий Манна – Уитни и χ² с поправкой Йетса. При подсчёте различий для сравнения малых выборок < 10 использовали также точный критерий Фишера. Данные представлены в виде медианы (Ме) и межквартильного интервала (МКИ), максимальных и минимальных значений.

Результаты

Частота гаплотипа 46/1 гена JAK2 в контрольной группе соответствовала данным, полученным для разных этнических групп, и не зависела от пола и возраста. Носительство гаплотипа 46/1 JAK2 в итоговой выборке из 949 больных, направленных гематологами на обследование с подозрением на МПН, выявлено у 573 (60 %) человек, что значимо (p < 0,05) отличается от частоты встречаемости данного гаплотипа (45 %) в контрольной группе (табл. 1).

Среди всех обследованных больных мутация JAK2V617F выявлена в 439 случаях (46 %), при этом частота обнаружения данной мутации была выше у больных с носительством гаплотипа 46/1 (52 %) в сравнении с больными без гаплотипа 46/1 (38 %). Отношение шансов выявления JAK2V617F у носителей гаплотипа 46/1 составило 2,7 (1,8–3,9) (табл. 1).

Другие драйверные мутации МПН в генах CALR, MPL и 12-м экзоне JAK2 также чаще обнаруживали в группе больных с гаплотипом 46/1 JAK2 (n = 573; 67 %), чем у больных (n = 376; 48 %), не имевших исследуемого гаплотипа.

В общей выборке выявили 127 (22 %) проб с мутациями в гене CALR, в том числе с мутациями 1-го типа — 47 человек, 2-го типа — 46 больных, неопределенного типа — 16 больных, а также 30 (5 %) больных с мутациями в гене MPL (5 — W515K и 15 — W515L). При этом в 18 (3 %) случаях наблюдали сочетанные мутации JAK2V617F и CALR, а также в 10 (2 %) случаях — JAK2V617F и MPL. При этом выявленные в образцах низкие (меньше 2 %) величины аллельной нагрузки мутации JAK2V617F, которые при отсутствии других драйверных мутаций МПН свидетельствуют о незлокачественном «клональном гемопоэзе неясного пролиферативного потенциала» (феномен «CHIP»), не зависели от наличия гаплотипа 46/1 JAK2 (табл. 3).

В таблице 2 представлены частоты встречаемости мутации JAK2 V617F и гаплотипа 46/1 (по результатам генотипирования локусов rs10974944 и rs3780367) у больных с подозрением на МПН из сибирских регионов Российской Федерации и Москвы. Распространенность JAK2V617F среди больных, направленных гематологами сибирских регионов для подтверждения диагноза МПН, варьировала от 22,6 % (при отсутствии носительства гаплотипа 46/1) до 80,0 % (в случае его гомозиготного варианта). Значимое влияние гетерозиготного или гомозиготного носительства гаплотипа 46/1 JAK2 на величину аллельной нагрузки мутации V617F было обнаружено в выборках всех сибирских регионов, кроме Иркутской области и Бурятии. Вместе с тем, в выборках из разных регионов были выявлены различия в возрасте и доле молодых мужчин среди обследованных больных, что сказалось на уровне статистической надежности полученных выводов.

В выборке больных, проходивших тестирование на мутацию JAK2V617F в ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора (Москва), частота её обнаружения была существенно ниже, чем у сибиряков: 9 % без гаплотипа 46/1 и 14 % в группе с гаплотипом 46/1 JAK2. При этом данная группа больных отличалась преобладанием более молодых (медиана возраста — менее 40 лет) и несбалансированностью по половому составу между сравниваемыми группами. В целом же по всей совокупной выборке больных частота выявления мутации JAK2V617F и её аллельная нагрузка значимо возрастали при увеличении в группе частоты носительства аллеля «G» гаплотипа 46/1 JAK2 (табл. 2).

Данные о влиянии пола и возраста на выраженность ассоциации гаплотипа 46/1 и мутации JAK2V617F представлены в таблице 4. Отношение шансов риска выявления мутации JAK2V617F (более чем 2 % аллельной нагрузки) были максимальны у мужчин в возрасте до 50 лет по сравнению с более старшей возрастной группой в 2,1 (1,26–3,40) раза.

Обсуждение

Основная гипотеза, которая проверялась в данном исследовании, заключалась в оценке зависимости взаимосвязи гаплотипа 46/1 гена и мутации JAK2V617F в выборках обследованных больных, отличавшихся по половозрастному составу и месту проживания. Исходя из предположения о первичности генетических нарушений в патогенезе онкогематологического заболевания, оценивали соотношение драйверных мутаций и гаплотипа 46/1 JAK2, независимо от факта подтверждения конкретных клинических вариантов МПН. Полученные результаты также оценивали в контексте соответствия конкурирующим гипотезам механизмов такой ассоциации: прямой «гипермутабельности» гена с гаплотипом 46/1 или «благоприятной почвы» для развития МПН, обусловленной влиянием гаплотипа 46/1 JAK2 на процессы воспаления. Показано соответствие частоты распределения гаплотипа 46/1 JAK2 среди российских здоровых добровольцев с данными об его распространенности среди здоровой популяции населения различных стран, при этом подтвердилась значимая ассоциация гаплотипа с выявлением драйверной мутации в гене JAK2 [1–12; 17–21]. Согласно литературным данным [3, 4], носительство гаплотипа 46/1 JAK2 обнаруживается у 40–80 % больных с JAK2V617F-позитивным вариантом МПН. В настоящей работе в объединённой выборке больных с клинически значимой (> 2 %) аллельной нагрузкой JAK2V617F гаплотип 46/1 определялся в 68,4 % случаев.

При этом на выборке больных с аллельной нагрузкой менее 2 % (табл. 3) подтверждены полученные раннее результаты [5], согласно которым отсутствует влияние гаплотипа 46/1 JAK2 на факт возникновения мутации этого гена. Более того, «клональный гемопоэз неясного пролиферативного потенциала», при котором наблюдаются низкие значения аллельной нагрузки JAK2V617F, скорее ассоциирован с альтернативными вариантами гаплотипа JAK2. Следовательно, предположение о «гипермутабельности» гена JAK2 при наличии его гаплотипа 46/1 как причины развития МПН не находит своего подтверждения.

В отличие от исследований, выполненных с участием 22 [6] или 38 [7] CALR-позитивных больных МПН, в протестированной выборке выявлена статистически значимая ассоциация гаплотипа 46/1 JAK2 и с другими драйверными соматическими мутациями в гене CALR, что согласуется с данными A.P. Trifa и соавт. [8] на выборке 170 больных МПН. Полученные результаты также подтверждают описанную в работе [9] тенденцию к более высокой частоте встречаемости гаплотипа 46/1 при МПН с мутациями в гене MPL (табл. 1). Таким образом, более высокая частота возникновения мутаций в генах CALR и MPL у носителей гаплотипа 46/1 в большей степени соответствует гипотезе «благоприятной почвы». Ранее опубликованы данные о значимой связи между гаплотипом 46/1 JAK2 и воспалительными заболеваниями, такими как язвенный колит и болезнь Крона. Возможное объяснение состоит в том, что гаплотип 46/1 JAK2 может способствовать чрезмерной выработке цитокинов с провоспалительным действием [22]. Авторы [23] показали связь носительства гаплотипа 46/1 JAK2 у реципиентов и доноров на исход трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток. Согласно результатам этого исследования [23], имеется значительное влияние гаплотипа 46/1 JAK2 на развитие реакции «трансплантат против хозяина», что подтверждает тот факт, что он может влиять на пути передачи сигналов провоспалительных цитокинов.

Ранее не исследовали связь гаплотипа 46/1 и JAK2V617F с распределением по возрасту и полу больных. В настоящей работе впервые выявлены более высокие значения отношения шансов выявления JAK2V617F при наличии гаплотипа 46/1 в когорте мужчин до 50 лет по сравнению с более старшей возрастной группой. Анализ базы данных позволил показать влияние пола на «возраст перелома» кривой накопления мутации JAK2V617F в популяции обследованных людей [24], гаплотип 46/1 JAK2 способствует сдвигу точки «возрастного перелома» в более молодые годы, и его влияние, очевидно, зависит от гендерных различий в возрасте старения системы иммунного надзора.

Наблюдаемые различия среди разных региональных выборок больных (табл. 2) как раз и обусловлены особенностями гендерной и возрастной структуры и не связаны с этническими особенностями или климатическими условиями проживания. В многочисленных исследованиях в разных странах также не выявлено существенных различий степени влияния гаплотипа 46/1 JAK2 на выявление JAK2V617F [17–21].

Более низкие показатели выявляемости мутации JAK2V617F в выборке московских архивных проб из ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии», очевидно, обусловлены более молодым возрастом больных, относительно низкой долей мужчин, а также меньшей селекцией в отношении онкогематологических заболеваний, в отличие от других регионов, в которых больные направлялись на оценку мутационного статуса при наличии клинически выраженных симптомов МПН и подтвержденных изменениях в гемограмме.

Определение гаплотипа 46/1 может быть полезным для предсказания вероятности возникновения драйверных мутаций МПН. Существенным ограничением данного исследования являлась анонимность полученных проб и отсутствие информации об итоговом клиническом диагнозе, что не позволило оценить возможную ассоциацию гаплотипа 46/1 JAK2 с отдельными нозологическими вариантами и прогнозом развития МПН.

Диагностическое значение определения гаплотипа 46/1 JAK2 описано также у больных острыми миелоидными лейкозами, при которых он более часто сопряжен с нормальным кариотипом и более короткой безрецидивной и общей выживаемостью по сравнению с больными без носительства 46/1 JAK2 [25]. Использование теста выявления носительства гаплотипа 46/1 JAK2 также может быть полезным и в дифференциальной диагностике МПН с Ph-позитивным хроническим миелолейкозом [26]. Перспективно выполнение комбинации теста на гаплотип 46/1 гена JAK2 с определением полиморфизмов TERT rs2736100 и MECOM rs2201862 [8], что позволит увеличить эффективность прогноза развития МПН задолго до проявления клинических симптомов заболевания.

Таким образом, результаты настоящего исследования подтверждают связь носительства варианта гаплотипа 46/1 JAK2 с частотой выявления и величиной аллельной нагрузки мутации V617F гена JAK2, а также с другими драйверными мутациями МПН в генах CALR и MPL. Впервые продемонстрирована более выраженная ассоциация гаплотипа 46/1 JAK2 с развитием МПН у мужчин до 50 лет. Полученные данные соответствуют гипотезе «благоприятного поля» механизмов взаимосвязи гаплотипа 46/1 и драйверных мутаций МПН.

Благодарности

Авторы выражают благодарность гематологам за помощь в выполнении данной работы: Сендеровой О.М. (Иркутск), Виноградовой Е.Ю. (Иркутск), Тереховой Л.Д. (Якутск), Соловьевой И.Е. (Якутск), Парфеновой С.Н. (Якутск), Гущину Д.С. (Норильск), Овсиенко Н.Г. (Абакан), Вершининой Г.Р. (Абакан), Сафроновой Н.В. (Абакан), Сарым-Олл А.Н. (Кызыл), Монгуш А.Х. (Кызыл) и Дуу-Дарый К.И. (Кызыл), а также научному сотруднику ФИЦ КНЦ СО РАН Коминой А.В. и студентке Сибирского федерального университета Плечко Е.А.